Palazzo AF, Gregory TR (2014) The Case for Junk DNA. PLoS Genet 10(5):
e1004351.
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1004351. Tradução: João Lucas.
Visão geral
Com o advento de tecnologias de sequenciamento profundo e a capacidade de analisar as sequências do genoma e transcriptoma completas, tem havido um crescente interesse em explorar funções putativas da fração muito grande do genoma comumente referida como "DNA lixo". Já que esta é uma questão de considerável importância na biologia do genoma, há uma tendência infeliz para pesquisadores e escritores de ciência proclamar regularmente o desaparecimento do DNA lixo, sem abordar adequadamente algumas das questões fundamentais que primeiro levaram ao surgimento do conceito. Nesta revisão, fornecemos uma visão geral dos principais argumentos que foram apresentados em apoio da noção de que uma grande parte da maioria dos genomas eucariotos não possui uma função a nível de organismo. Alguns deles são baseados em observações ou princípios genéticos básicos que têm décadas de idade, enquanto outros resultam de novos conhecimentos sobre processos moleculares, como transcrição e regulação de genes.
Com o advento de tecnologias de sequenciamento profundo e a capacidade de analisar as sequências do genoma e transcriptoma completas, tem havido um crescente interesse em explorar funções putativas da fração muito grande do genoma comumente referida como "DNA lixo". Já que esta é uma questão de considerável importância na biologia do genoma, há uma tendência infeliz para pesquisadores e escritores de ciência proclamar regularmente o desaparecimento do DNA lixo, sem abordar adequadamente algumas das questões fundamentais que primeiro levaram ao surgimento do conceito. Nesta revisão, fornecemos uma visão geral dos principais argumentos que foram apresentados em apoio da noção de que uma grande parte da maioria dos genomas eucariotos não possui uma função a nível de organismo. Alguns deles são baseados em observações ou princípios genéticos básicos que têm décadas de idade, enquanto outros resultam de novos conhecimentos sobre processos moleculares, como transcrição e regulação de genes.
Introdução
A busca por função no genoma
Sabe-se há várias décadas que apenas uma pequena fração do genoma humano é composta por sequências codificadoras de proteínas e que pelo menos alguns DNA não codificantes possuem importantes funções biológicas. Além de codificar éxons, o genoma contém sequências que são transcritas em moléculas de RNA funcionais (por exemplo, tRNA, rRNA e snRNA), regiões reguladoras que controlam a expressão gênica (por exemplo, promotores, silenciadores e potenciadores), origens de replicação e repetições que desempenham papéis estruturais no nível cromossômico (por exemplo, telômeros e centrômeros).
Sabe-se há várias décadas que apenas uma pequena fração do genoma humano é composta por sequências codificadoras de proteínas e que pelo menos alguns DNA não codificantes possuem importantes funções biológicas. Além de codificar éxons, o genoma contém sequências que são transcritas em moléculas de RNA funcionais (por exemplo, tRNA, rRNA e snRNA), regiões reguladoras que controlam a expressão gênica (por exemplo, promotores, silenciadores e potenciadores), origens de replicação e repetições que desempenham papéis estruturais no nível cromossômico (por exemplo, telômeros e centrômeros).
Novas descobertas sobre sequências potencialmente importantes entre a maioria não-codificadora de proteína do genoma estão se tornando mais prevalentes. De longe, o esforço mais conhecido para identificar regiões funcionais no genoma humano é o projeto Enciclopédia de Elementos de DNA (ENCODE) recentemente concluído, cujos autores fizeram a afirmação notável de que uma "função bioquímica" poderia ser atribuída a 80% de o genoma humano [2]. Relatos de que a ENCODE tinha refutado a existência de grandes quantidades de DNA lixo no genoma humano receberam considerável atenção da mídia [3], [4]. As críticas de que essas afirmações se basearam em uma definição extremamente vaga de "função" logo se seguiram [5] – [8] (para uma discussão sobre os conceitos de função relevantes, veja [9]), e continua o debate sobre a interpretação mais apropriada dos resultados da ENCODE. No entanto, a excitação e a contração subsequente serviram para ilustrar o interesse generalizado entre cientistas e não especialistas em determinar o quanto do genoma humano é funcionalmente significativo ao nível do organismo.
A origem do "DNA lixo"
Embora o termo "DNA lixo" já estivesse em uso já na década de 1960 [10] – [12], a origem do termo é geralmente atribuída a Susumu Ohno [13]. Como Ohno apontou, a duplicação de genes pode aliviar a restrição imposta pela seleção natural em mudanças em importantes regiões gênicas, permitindo que uma cópia mantenha a função original enquanto a outra sofre mutação. Raramente, essas mutações acabarão por ser benéficas, e um novo gene pode surgir ("neofuncionalização") [14]. Na maioria das vezes, no entanto, uma cópia sustenta uma mutação que elimina sua capacidade de codificar uma proteína funcional, transformando-a em um pseudogene. Essas sequências são o que Ohno inicialmente se referiu como "lixo" [13], embora o termo tenha sido ampliado rapidamente para incluir muitos tipos de DNA não-codificantes [15]. Hoje, o "DNA lixo" é frequentemente usado no sentido amplo de se referir a qualquer sequência de DNA que não desempenha um papel funcional no desenvolvimento, na fisiologia ou em alguma outra capacidade a nível de organismo. Este sentido mais amplo do termo está no centro do debate mais atual sobre a quantidade — ou mesmo a existência — de "DNA lixo" nos genomas dos seres humanos e de outros organismos.
Embora o termo "DNA lixo" já estivesse em uso já na década de 1960 [10] – [12], a origem do termo é geralmente atribuída a Susumu Ohno [13]. Como Ohno apontou, a duplicação de genes pode aliviar a restrição imposta pela seleção natural em mudanças em importantes regiões gênicas, permitindo que uma cópia mantenha a função original enquanto a outra sofre mutação. Raramente, essas mutações acabarão por ser benéficas, e um novo gene pode surgir ("neofuncionalização") [14]. Na maioria das vezes, no entanto, uma cópia sustenta uma mutação que elimina sua capacidade de codificar uma proteína funcional, transformando-a em um pseudogene. Essas sequências são o que Ohno inicialmente se referiu como "lixo" [13], embora o termo tenha sido ampliado rapidamente para incluir muitos tipos de DNA não-codificantes [15]. Hoje, o "DNA lixo" é frequentemente usado no sentido amplo de se referir a qualquer sequência de DNA que não desempenha um papel funcional no desenvolvimento, na fisiologia ou em alguma outra capacidade a nível de organismo. Este sentido mais amplo do termo está no centro do debate mais atual sobre a quantidade — ou mesmo a existência — de "DNA lixo" nos genomas dos seres humanos e de outros organismos.
Agora se tornou um clichê nas histórias da mídia e artigos de periódicos começar com a afirmação simplista de que a maioria ou todo o DNA não-codificante foi "por muito tempo desmerecido como lixo inútil". A implicação, é claro, é que a pesquisa atual está revelando função para muito do suposto lixo que foi imprudentemente ignorado como biologicamente desinteressante pelos pesquisadores do passado. No entanto, simplesmente não é verdade que as funções potenciais para o DNA não-codificante foram ignoradas até recentemente. Na verdade, vários dos primeiros comentaristas consideraram a noção de que grandes faixas do genoma não eram funcionais como sendo "repugnante" [10], [16], e as possíveis funções foram discutidas sempre que um novo tipo de sequência não-codificadora de proteína era identificada (incluindo pseudogenes , elementos transponíveis, DNA satélite e íntrons; para uma compilação da literatura relevante, veja [17]).
Importante, o conceito de DNA lixo não se baseou na ignorância sobre os genomas. Pelo contrário, o termo refletiu detalhes conhecidos sobre a variabilidade do tamanho do genoma, o mecanismo de duplicação de genes e degradação mutacional e a teoria da genética populacional. Além disso, cada uma dessas observações e considerações teóricas permanece válida. Nesta revisão, examinamos várias linhas de evidência — tanto empíricas quanto conceituais — que sustentam a noção de que uma porcentagem substancial do DNA em muitos genomas eucariotos não possui uma função a nível de organismo e que o conceito de DNA lixo permanece viável pós-ENCODE.
Tamanho do Genoma e "O Teste da Cebola"
Existem vários pontos-chave a serem entendidos em relação à diversidade do tamanho do genoma entre os eucariotos e sua relação com o conceito de DNA lixo. Primeiro, o tamanho do genoma varia enormemente entre as espécies [18], [19]: pelo menos 7.000 vezes entre os animais e 350 vezes, mesmo dentro dos vertebrados. Em segundo lugar, o tamanho do genoma varia independentemente das noções intuitivas da complexidade do organismo ou do número presumido de genes que codificam proteínas (Figura 1). Por exemplo, um genoma humano contém oito vezes mais DNA do que o de um baiacu, mas 40 vezes menos do que o de um peixe pulmonado. Em terceiro lugar, os organismos que têm genomas muito grandes não são poucos em número, nem são outliers — por exemplo, dos 200 genomas de salamandras analisados até agora, todos estão entre quatro e 35 vezes maiores do que o genoma humano [18]. Em quarto lugar, mesmo espécies estreitamente relacionadas com propriedades biológicas muito similares e o mesmo nível de ploidia podem diferir significativamente no tamanho do genoma.
Existem vários pontos-chave a serem entendidos em relação à diversidade do tamanho do genoma entre os eucariotos e sua relação com o conceito de DNA lixo. Primeiro, o tamanho do genoma varia enormemente entre as espécies [18], [19]: pelo menos 7.000 vezes entre os animais e 350 vezes, mesmo dentro dos vertebrados. Em segundo lugar, o tamanho do genoma varia independentemente das noções intuitivas da complexidade do organismo ou do número presumido de genes que codificam proteínas (Figura 1). Por exemplo, um genoma humano contém oito vezes mais DNA do que o de um baiacu, mas 40 vezes menos do que o de um peixe pulmonado. Em terceiro lugar, os organismos que têm genomas muito grandes não são poucos em número, nem são outliers — por exemplo, dos 200 genomas de salamandras analisados até agora, todos estão entre quatro e 35 vezes maiores do que o genoma humano [18]. Em quarto lugar, mesmo espécies estreitamente relacionadas com propriedades biológicas muito similares e o mesmo nível de ploidia podem diferir significativamente no tamanho do genoma.
Figura 1. Resumo dos conteúdos de DNA nuclear haplóide ("tamanhos do genoma") para vários grupos de eucariotos.Este gráfico é baseado em dados para cerca de 10 000 espécies [18], [19]. Existe uma ampla gama de tamanhos de genoma, mesmo entre espécies semelhantes em desenvolvimento, e não há correspondência entre o tamanho do genoma e a complexidade geral do organismo. Os seres humanos, que têm um genoma de tamanho médio para um mamífero, são indicados por uma estrela. Observe a escala logarítmica.
Essas observações representam um desafio importante para qualquer afirmação de que a maioria do DNA eucariótico é funcional ao nível do organismo. Essa lógica talvez seja melhor ilustrada invocando "o teste da cebola" [20]. A cebola doméstica, Allium cepa, é uma planta diploide (2n = 16) com um tamanho de genoma haplóide de aproximadamente 16 bilhões de pares de bases (16 Gbp), ou cerca de cinco vezes maior que os humanos. Embora qualquer número de espécies com genomas grandes possam ser escolhidos para essa comparação, o teste da cebola simplesmente pergunta: se a maioria do DNA eucariótico é funcional no nível do organismo, seja para regulação de genes, proteção contra mutações, manutenção de estrutura cromossômica ou qualquer outro papel desse tipo, então, por que uma cebola exige cinco vezes mais do que um ser humano? Importante, a comparação não se restringe às cebolas versus humanos. Poderia ser tão simplesmente entre baicus e peixes pulmonados, que diferem em ~ 350 vezes, ou membros do gênero Allium, que possuem mais do que um intervalo de 4 vezes no tamanho do genoma e que não é o resultado da poliploidia [21].
Em resumo, a noção de que a maioria do DNA não-codificante eucariótico é funcional é muito difícil de conciliar com a enorme diversidade no tamanho do genoma observado entre as espécies, incluindo alguns táxons relacionados. O teste da cebola é meramente uma reformulação desta questão, que tem sido bem conhecida pelos biólogos do genoma por muitas décadas [18].
Composição do Genoma
Outra consideração importante é a composição dos genomas eucarióticos. Longe de ser composto de "matéria escura" misteriosa, as características das sequências que constituem 98% ou mais do genoma humano que não-codificam proteína são geralmente bem compreendidas.
Elementos transponíveis
De longe, o tipo dominante de DNA não-gênico são elementos transposíveis (ETs), incluindo vários retroelementos bem descritos, como elementos nucleares intercalares curtos e longos (SINEs e LINEs), retrovírus endógenos e transpósons de DNA cortar-e-colar. Devido à sua capacidade de aumentar em número de cópias, os elementos transponíveis foram descritos há muito tempo como "parasitas" ou "egoístas" [22], [23]. No entanto, a grande maioria desses elementos são inativos em seres humanos, devido a uma fração muito grande ser altamente degradada por mutação. Devido a essa degeneração, as estimativas da proporção do genoma humano ocupado por ETs variaram amplamente, entre metade e dois terços [24], [25]. Os genomas maiores, como os de salamandras e peixes pulmonados, quase certamente contêm uma quantidade ainda mais enorme de DNA de elementos transponíveis [26], [27].
Muitos exemplos foram encontrados em que ETs assumiram papéis regulatórios ou outros funcionais no genoma [28]. Em reconhecimento das interações mais complexas entre elementos transponíveis e seus hospedeiros, Kidwell e Lisch propuseram uma expansão do quadro de "parasitismo" onde cada ET pode ser classificado ao longo de um espectro, do parasitismo ao mutualismo [29]. No entanto, há evidências de função a nível de organismo para apenas uma pequena minoria de sequências de ET. Portanto, não é óbvio que as explicações funcionais podem ser extrapoladas a partir de um pequeno número de exemplos específicos para todos os ETs dentro do genoma.
DNA altamente repetitivo
Outra grande fração do genoma consiste em DNA altamente repetitivo. Essas regiões são extremamente variáveis, mesmo entre indivíduos da mesma população (daí o uso deles como "impressões digitais de DNA") e podem expandir-se ou contrair-se por meio de processos como crossing over desigual ou deslizamento de replicação. Muitas repetições são pensadas como sendo derivadas de ETs truncados, mas outros consistem em matrizes em tandem de di e trinucleótidos [30]. Tal como acontece com os ETs, algumas sequências altamente repetitivas desempenham um papel na regulação de genes (por exemplo, [31]). Outros, tais como repetições associadas teloméricas e centroméricas [32], [33], desempenham papéis críticos na manutenção cromossômica. Apesar disso, atualmente não há evidências de que a maioria dos elementos altamente repetitivos sejam funcionais.
Íntrons
De acordo com o Gencode v17, cerca de 40% do genoma humano é composto por regiões intrônicas; No entanto, esse número provavelmente é uma superestimação, pois inclui todos os eventos anotados. Também é importante notar que uma grande fração de ETs e elementos repetitivos são encontrados nos íntrons. Embora os íntrons possam aumentar a diversidade de produtos protéicos, modulando o splicing alternativo, também é claro que a grande maioria da seqiência intrônica evolui de forma não restrita, acumulando mutações na mesma proporção que as regiões neutras. Embora o tamanho médio do íntron em seres humanos seja de ~ 1,5 kb [30], os dados sugerem que a maioria da sequência restrita é confinada aos primeiros e últimos 150 nucleótideos [34].
Pseudogenes
O genoma humano também abriga um grande número de pseudogenes. As estimativas do número total variam de 12.600 a 19.700 [35]. Estes incluem pseudogenes "clássicos" (duplicatas diretas, do tipo imaginado por Ohno [13]) e pseudogenes "processados", que são transcritos reversamente a partir do mRNA [36]. Mais uma vez, embora alguns pseudogenes tenham sido cooptados para uma função ao nível de organismo (por exemplo, ver [37]), a maioria simplesmente está evoluindo sem restrições seletivas em suas sequências e provavelmente não tem função [38].
Sequências conservadas
Várias análises de conservação de sequência entre humanos e outros mamíferos descobriram que cerca de 5% do genoma é conservado [1], [39] – [42]. É possível que 4% adicionais do genoma humano estejam sob pressão de seleção linhagem-específica [39]; no entanto, esta estimativa parece ser um pouco questionável [43], [44] (veja também [45]). Ignorando esses problemas, a idéia de que 9% do genoma humano mostra sinais de funcionalidade é realmente consistente com os resultados do ENCODE e outras análises de genoma em grande escala.
Além das sequências codificadoras de proteínas (incluindo regiões não traduzidas associadas), que compõem 1,5% -2,5% do genoma humano [24], os dados do ENCODE sugerem que os longos RNAs não-codificantes conservados (lncRNA) são gerados a partir de cerca de 9 000 loci, que soma menos de 0,4% adicional [46], [47]. Assim, mesmo que um vasto e novo mundo não explorado de RNA não-codificante funcional seja descoberto, isso provavelmente será transcrito a partir de uma pequena fração do genoma humano.
À primeira vista, as sequências que são vinculadas por fatores de transcrição (TFs) parecem ser muito abundantes, constituindo cerca de 8,5% do genoma de acordo com ENCODE [2]. Este número, no entanto, é uma estimativa de regiões que são hipersensíveis ao tratamento com DNase I devido ao deslocamento de nucleossomas por TFs. Conforme assinalado por outros [6], essas regiões são anotadas como sendo de várias centenas de nucleótideos de comprimento e, portanto, são muito maiores do que o tamanho real de motifs individuais de ligação à TFs, que normalmente são de 10 pb de comprimento [48]. Segundo as próprias estimativas da ENCODE, menos da metade das bases nucleotídocas nessas regiões de hipersensibilidade de DNase I contêm motifa reais de reconhecimento de TF [2], e apenas 60% estão sob seleção purificadora [49]. Outros descobriram que os eventos de ligação a TF fracos e transitórios são rotineiramente identificados por experiências de cromatina IP apesar do fato de que elas não contribuem significativamente para a expressão gênica [50] – [53] e são mal conservadas [53]. Dado que as experiências realizadas em um número diversificado de sistemas eucarióticos encontraram apenas uma pequena correlação entre os eventos de ligação ao TF e a expressão do mRNA [54], [51], parece que na maioria dos casos, apenas uma fração de locais de ligação ao TF afeta significativamente os locais expressão gênica.
Em resumo, a maioria dos principais constituintes do genoma foram bem caracterizados. A maioria do DNA humano consiste em sequências repetitivas e degradadas mutacionalmente. Existem exemplos inequívocos de sequências não-codificadoras de proteína de vários tipos que foram cooptadas para funções a nível de organismo na regulação de genes, estrutura cromossômica e outros papéis, mas, no presente, a evidência da literatura publicada sugere que estes representam uma pequena minoria da genoma humano.
Forças evolutivas
Para entender o estado atual do genoma humano, precisamos examinar como ele evoluiu, e como Michael Lynch escreveu uma vez: "Nada na evolução faz sentido exceto à luz da genética populacional" [55]. Infelizmente, os conceitos que foram gerados por este campo não foram amplamente reconhecidos em outros domínios das ciências da vida. Em particular, o que é subestimado por muitos especialistas em não-evolução é que grande parte da evolução molecular nos eucariotos é principalmente o resultado da deriva genética ou a fixação de mutações neutras. Esta visão tem sido amplamente apreciada por biólogos evolutivos moleculares nos últimos 35 anos.
A teoria quase neutra da evolução molecular
Um desenvolvimento importante na compreensão de como várias forças evolutivas moldaram genes e genomas eucarióticos vieram com as teorias desenvolvidas por Kimura, Ohta, King e Jukes. Eles demonstraram que os alelos que eram ligeiramente benéficos ou deletérios se comportaram como alelos neutros, desde que o valor absoluto de seu coeficiente de seleção fosse menor que o inverso do tamanho da população "efetiva" [56] – [59]. Em outras palavras, é importante ter em mente o tamanho da população quando se pensa se as mutações deletérias estão sujeitas a seleção purificadora.
Também é importante perceber que o tamanho da população "efetiva" depende de muitos fatores e geralmente é muito menor do que o número total de indivíduos em uma espécie [55]. Para os seres humanos, estima-se que o tamanho histórico efetivo da população seja aproximadamente 10.000, e este é o lado baixo em comparação com a maioria dos metazoários [60]. Dado os números baixos globais para os organismos multicelulares em geral, esperamos que a seleção natural seja impotente para impedir o acúmulo de certas alterações genômicas na totalidade da evolução dos metazoários. Um tipo de mutação que se encaixa nesta descrição é inserção intergênica, seja ele elementos transposíveis, pseudogenes ou sequência aleatória [55]. A criação e a perda de motifs de ligação à TFs ou sítio de início de transcrição crípticos nessas mesmas regiões intergênicas serão igualmente invisíveis para a seleção natural, desde que não alterem drasticamente a expressão de quaisquer genes próximos ou causem a produção de transcritos tóxicos estáveis. Assim, um princípio central da teoria quase neutra da evolução molecular é que as sequências de DNA estranhas podem estar presentes nos genomas, desde que não tenham impacto significativo na aptidão do organismo.
Carga genética
Reconhece-se há muito tempo que existe um limite para o número de mutações deletérias que um organismo pode sustentar por geração [61], [62]. A presença dessas mutações geralmente não é prejudicial, porque os organismos diplóides geralmente requerem apenas uma cópia funcional de qualquer gene. No entanto, se a taxa em que essas mutações são geradas for maior do que a taxa em que a seleção natural pode eliminá-las, então os genomas coletivos dos organismos nas espécies sofrerão um colapso quando o número total de alelos deletérios aumentarem com cada geração [63]. Esta taxa é aproximadamente uma mutação deletéria por geração. Neste contexto, fica claro que a taxa de mutação global colocaria um limite superior na quantidade de DNA funcional. Atualmente, a taxa de mutação em seres humanos é estimada em algum lugar entre 70-150 mutações por geração [64], [65]. Por esta linha de raciocínio, estimaríamos que, no máximo, apenas 1% dos nucleotídeos no genoma são essenciais para a viabilidade de uma maneira sequência-específica estrita. No entanto, modelos computacionais mais recentes demonstraram que os genomas poderiam sustentar múltiplas mutações ligeiramente deletérias por geração [66]. Usando métodos estatísticos, estima-se que os seres humanos sustentem 2.1-10 mutações deletérias por geração [66] - [68]. Esses dados sugerem que, no máximo, 10% do genoma humano exibe função detectável de nível de organismo e inversamente que pelo menos 90% do genoma consiste em DNA lixo. Essas figuras concordam com as medidas de conservação do genoma (~9%, ver acima) e são incompatíveis com a visão de que 80% do genoma é funcional no sentido implícito da ENCODE. Continua a ser possível que grandes quantidades de DNA não-codificante possuam papéis estruturais ou outros independentes da sequência de nucleotídeos, mas não é óbvio como isso seria conciliado com o "teste de cebola".
A evolução do núcleo
Ao lidar com a evolução de qualquer linhagem, é preciso também ter em mente eventos únicos, também conhecidos como contingências históricas, que restringem e moldam as trajetórias evolutivas subsequentes [69]. Um desses eventos-chave em nossa própria ascendência foi a evolução do núcleo eucariótico. Um exame adicional de por que o núcleo evoluiu e como esta função celular alterada pode gerar insights importantes sobre a forma atual do genoma eucariótico.
Um evento importante no princípio da evolução eucariótica foi o desenvolvimento de uma relação simbiótica entre o progenitor α-proteobactéria das mitocôndrias e um hospedeiro semelhante a uma arqueobacteria [70], [71]. Tal como acontece com a maioria das organelas endossimboticamente derivadas [72], o DNA foi transferido das mitocôndrias para o hospedeiro. Desta forma, os íntrons do Grupo II, que ainda se encontram nas mitocôndrias e α-proteobactérias [73], invadiram o genoma do hospedeiro. Os íntrons do Grupo II são fragmentos de DNA parasitários que se replicam quando são transcritos, tipicamente como parte de um transcrito maior. O íntron então se dobra em uma ribozima catalítica que se separa da transcrição do precursor e depois se reinsere em um novo locus genômico ao reverter a reação splicing. Importante, fragmentos funcionais de íntrons do Grupo II podem unir as versões inativas em uma reação de trans-splicing [74], [75]. Conforme descrito em outro lugar, é provável que os íntrons do Grupo II tenham proliferado e evoluído em duas populações: cópias inativadas, que poderiam ser empalhadas em trans, e fragmentos ativos que promovem o splicing do grupo anterior. Este último grupo evoluiu para os snRNAs spliceossomais [75] - [77]. Esta ideia é suportada não apenas por semelhanças estruturais, catalíticas e funcionais entre os íntrons do Grupo II e os snRNAs [78], [79], mas também pelo fato de que a expressão do snRNA U5 resgata o splicing dos íntrons do Grupo II que não possuem a região similar a U5 correspondente [80].
É provável que a proliferação de trans-splicing desencadeou a segregação espacial do processamento de RNA (o nucleoplasma) da maquinaria de tradução (o citoplasma) [77]. Esta subdivisão garantiu que os mRNAs sofressem o devido splicing antes de encontrarem a maquinaria de tradução. Não só essa segregação impediria os ribossomos da tradução de interferir com a reação de splicing (e vice-versa), mas também evitaria a tradução de mRNAs incompletamente processados, que geralmente codificam proteínas tóxicas [81], [82]. Importante, a segregação da tradução tanto da transcrição como do processamento de RNA proporcionou uma oportunidade para os processos de controle de qualidade nuclear para eliminar transcrições mal processadas e espúrias que não atendiam aos requisitos mínimos de "identidade de mRNA" (veja abaixo) antes que esses RNAs já tivessem encontrado um ribossomo . Isso, por sua vez, permitiu que o DNA intergênico e os locais críticos de início da transcrição se proliferassem com um custo mínimo para a aptidão do organismo. Também deve notar-se que o aumento da regeneração de ATP devido a caminhos metabólicos derivados de mitocôndria proporcionou a energia excedente necessária para suportar uma expansão não apenas no tamanho e nas membranas do genoma [83], [84], mas também na transcrição desperdiçosa. Assim, por vários mecanismos independentes, a aquisição de mitocôndrias provavelmente permitiu a expansão do DNA intergênico não funcional e a evolução de um sistema transcricional ruidoso.
Expressão gênica em eucariotos
A transcrição eucariótica é inerentemente barulhenta
Uma das descobertas mais discutidas da última década da análise de transcriptoma é que grande parte do genoma metazoário é transcrita em algum nível (embora isso, também, já tenha sido reconhecido em um esboço bruto na década de 1970 [15]). Quando transcriptos nascendos do camundongo foram analisadas por sequenciamento profundo, o número total de leituras que mapeiam para loci intergênicos é quase equivalente ao mapeamento de números para regiões exônicas (Figura 2A, reproduzidas a partir da referência [85]). Isso é consistente com a observação de que uma grande fração do grupo celular da RNA Polymerase II está associada a regiões intergênicas [86] e que a transcrição pode ser iniciada em sequências aleatórias (ver Figura S4 em [87]) e regiões livres de nucleossomos [ 88], [89]. Surpreendentemente, quando se examina o nível estacionário de RNA poliadenilado, mapas muito pouco é mapeado para regiões intergênicas (Figura 2A, 2B, o último reproduzido a partir da referência [46], veja também [85], [90] - [92]). Na verdade, quando se elimina as 9 000 espécies de transcrito que se pensa serem derivadas de lncRNA conservado, a maioria dos RNAs poliadenilados não-coficifantes anotados estão presentes em níveis abaixo de uma cópia por célula e são encontrados exclusivamente no núcleo (Figura 2B). A situação não é melhor no grupo não poliadenilado, na qual a quantidade de lncRNA e RNA intergênico é praticamente insignificante, especialmente no grupo citoplasmático (Figura 2B). Em conunto, esses dados indicam que a maioria dos RNAs intergênicos são degradados quase imediatamente após a transcrição. De acordo com esta ideia, o nível de transcritos intergênicos aumenta quando a maquinaria de degradação de RNA é inibida [93] - [101]. Embora a transcrição pervasiva tenha sido utilizada como argumento contra o DNA lixo [3], [4], na verdade ela está inteiramente de acordo com a idéia de que as regiões intergênicas estão evoluindo sob pouca ou nenhuma restrição, especialmente quando se considera que esta transcrição intergênica é instável.
Figura 2. Níveis de codificação de proteínas e RNAs intergênicos em células de mamíferos. (A) Análise dos níveis de poli (A) + RNA nascentes e total em núcleos de fígado de rato. O RNA nascente (i.e.,associado à polimerase) e poli (A) + RNA foram isolados a partir de núcleos de fígado de rato e analisados por sequenciamento de alto rendimento. As leituras individuais foram categorizadas por sua fonte. Exônico e intrónico são de genes referenciados conhecidos (isto é, genes "RefSeq"), enquanto que os gêneros intergênicos são originários de loci não referenciados (isto é, "não-RefSeq") no genoma do camundongo. Reproduzido a partir de [85]. (B) Função de distribuição cumulativa empírica (ECDF) da expressão da transcrição em cada compartimento celular conforme determinado pelos consórcios ENCODE. Os resultados para RNA que contenham ("polyA +") ou careçam ("polyA-") de uma cauda poli-A são no núcleo e as frações citosólicas são mostradas. Cada linha celular humana que foi analisada é representada por três linhas, uma por cada grupo de RNA (vermelho para RNAs coficadores proteínas, azul para lncRNAs ["não-codificadores"] e verde para transcritos intergênicos ["romance intergênico"]). As linhas indicam a fração cumulativa de RNAs em um determinado agrupamento (eixo-y) que são expressos em níveis iguais ou inferiores às leituras por kilobase por milhão de leituras mapeadas (RPKM) no eixo dos x. Os números totais em cada grupo são os seguintes: genes de referência que codificam proteínas: 20.679, loci produtores de lncRNAs: 9.277 e regiões que produzem transcritos intergênicos: 41.204. As transcrições com níveis de expressão de 0 RPKM foram ajustadas para um valor artificial de 10-6 RPKM, de modo que o início de cada gráfico representa a fração de genes ou loci não expressos. Note-se que 1-4 RPKM é aproximadamente equivalente a uma cópia por célula de cultura de tecidos [46], [129]. Usando essa figura, pode-se facilmente deduzir que a grande maioria dos transcritos intergênicos estão presentes em níveis inferiores a uma cópia por célula. Reproduzido com permissão de [46].
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1004351.g002
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1004351.g002
Identificando o mRNAs de transcrição intergênica
Um tema comum que surgiu a partir do estudo da síntese de mRNA é que vários passos na síntese e processamento de RNA são acoplados bioquimicamente. Em outras palavras, maquinários celulares que participam de uma atividade bioquímica também promovem etapas subsequentes. Por exemplo, durante o splicing do íntro que está mais a 5'most, o spliceossomo colabora com o complexo de ligação do cap-5' para depositar fatores de exportação nuclear na extremidade 5' do transcrito processadp [102], [103], o que ajuda a explicar por que o splicing aumenta a exportação nuclear de mRNA [104] – [106]. Existem inúmeros outros exemplos de acoplamento (para revisões, veja [107] – [111]).
O objetivo final dessas reações de acoplamento é escolher RNAs que codificam proteína (isto é, mRNA) a partir de transcritos intergênicos [111], [112]. Dado que, em média, os genes codificadores de proteínas têm oito íntrons [30], enquanto a maioria dos transcritos intergênicos anotados pela ENCODE tendem a não ter sofrido splicing [46], os íntrons ajudam a distinguir essas duas populações e, portanto, servem como marcadores de "identidade de mRNA". Esses recursos de identidade do mRNA ativam as reações de acoplamento, que por sua vez promovem o processamento posterior, a exportação nuclear e a tradução de um transcrito particular. Do mesmo modo, outras classes de RNAs funcionais (por exemplo, tRNAs e snRNAs) têm seus próprios elementos de identidade [113]. Em contrapartida, os transcritos que não possuem elementos de identidadei são direcionadas para a degradação. De acordo com este modelo, as moléculas de RNA sem íntrons que têm uma sequência aleatória são pobremente exportadas do núcleo e têm uma meia-vida muito curta [114], [115]. Em contraste, os mRNAs sem íntrons têm motifs especializados que promovem a exportação nuclear [105], [116] – [119].
À luz do fato de que muitos lncRNA funcionais desempenham um papel na regulação da estrutura da cromatina ou da transcrição, não é surpreendente que a maioria se localize no nucleoplasma [46]. Pode-se prever que os lncRNAs contêm um conjunto diferenciado de elementos de identidade que não só servem para prevenir a sua deterioração, mas também retém-los no núcleo. Isto seria especialmente crítico para lncRNAs que são submetidos a splicing. Apesar disso, os elementos que regulam a localização e a estabilidade desses RNAs receberam pouca atenção, mas podem ser informados pela visão de que eles podem ter seus próprios marcadores de identidade.
Também é importante ressaltar que os eucariotos possuem outros mecanismos que degradam os mRNA aberrantes (por exemplo, nonsense-mediated decay) ou limitam a quantidade de transcrição intergênica (por exemplo, heterocromatina). No entanto, os eucariotos parecem ter evoluído uma intrincada rede de reações de acoplamento que são necessárias para lidar com uma grande carga de RNA lixo. Essas descobertas são consistentes com a idéia de que os genomas eucariotos são preenchidos com DNA lixo que é transcrito em um nível baixo.
Também é importante ressaltar que os eucariotos possuem outros mecanismos que degradam os mRNA aberrantes (por exemplo, nonsense-mediated decay) ou limitam a quantidade de transcrição intergênica (por exemplo, heterocromatina). No entanto, os eucariotos parecem ter evoluído uma intrincada rede de reações de acoplamento que são necessárias para lidar com uma grande carga de RNA lixo. Essas descobertas são consistentes com a idéia de que os genomas eucariotos são preenchidos com DNA lixo que é transcrito em um nível baixo.
Uma visão alternativa da transcrição e da conservação?
Na tentativa de contrariar o argumento de que a conservação de sequências é um pré-requisito para a funcionalidade, recentemente foi proposto que certos eventos transcricionais possam desempenhar algum papel na regulação da função celular, apesar do fato de que a sequência do produto transcripcional não é restringida [120]. De fato, essa visão está de acordo com os achados de que a transcrição de certos genes de levedura é inibida como consequência da produção de transcritos crípticos instáveis provenientes de promotores a montante e / ou a jusante (para uma revisão, ver [121]). Outros exemplos ligaram a geração de transcritos crípticos instáveis a modificações da cromatina [101], [122], metilação do DNA [123] e estabilidade do DNA [124]. No entanto, não está claro se a maioria dos RNAs não-codificantes instáveis têm algum efeito no DNA ou na cromatina, e muito menos contribuem para a aptidão do organismo. Nos casos em que os eventos transcricionais crípticos e instáveis afetam a expressão gênica, eles geralmente consistem em transcritos curtos que são sintetizados a partir de regiões ao redor dos locais de início da transcrição ou dentro do próprio gene [121]. Na verdade, a maioria dos dados disponíveis são consistentes com o fato de que os sítios de início da transcrição são promíscuos, gerando frequentemente transcrição bidirecional [100], [101], e que processos de acoplamento subsequentes, como a interação entre complexos associados ao promotor e fatores de processamento da extremidade 3', são necessários para impor direcionalidade transcricional adequada [125]. Outras transcrições instáveis funcionam para promover ou manter a formação de heterocromatina na proximidade do local da transcrição, provavelmente porque essas regiões produzem transcrições tóxicas [122]. Embora esta forma de transcrição tenha uma função (isto é, para manter um estado repressivo), não é claro que a eliminação dessas regiões tenha algum efeito sobre o organismo [8]. A transcrição de outros transcritos pouco instáveis, principalmente produzidos a partir de regiões intensificadoras, mostrou promover a expressão gênica [126]; No entanto, novamente, esses "RNAs potenciadores" são transcritos a partir de uma pequena fração do genoma total [127]. Conforme afirmado por outros [128], é imperativo que aqueles que afirmam que a grande maioria da transcrição intergênica é funcional testem suas hipóteses. Na ausência desta evidência, a declaração de que estamos em meio a uma mudança de paradigma no que diz respeito aos genomas eucariotos e à expressão gênica [120] parece prematura.
Observações finais
Durante décadas, houve um interesse considerável em determinar qual o papel, se houver, que a maioria do DNA em genomas eucariotos desempenha no desenvolvimento organizacional e na fisiologia. Os dados ENCODE são apenas a contribuição mais recente para um programa de pesquisa de longa data que procurou abordar esta questão. No entanto, a evidência que duvida que a maior parte do genoma humano possui um papel funcional existe há algum tempo. Isso não quer dizer que nenhuma da maioria não-codificadora de proteínas do genoma é funcional — exemplos de sequências funcionais não-codificantes são conhecidos há mais de meio século e até mesmo os primeiros defensores do "DNA lixo" e do "DNA egoísta" previram que outros exemplos seriam encontrados. No entanto, eles também apontaram que as considerações evolutivas, a informação sobre a diversidade do tamanho do genoma e o conhecimento sobre as origens e características dos componentes genômicos não suportam a noção de que todo o DNA deve ter uma função em virtude de sua mera existência. Nada nas pesquisas ou comentários recentes sobre o assunto desafiou essas observações.
Agradecimentos
Gostaríamos de agradecer a L. Moran, S. Eddy, D. Graur, R. Hardison, J. Wan e A. Akef pelos comentários úteis sobre o manuscrito.
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